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详细内容

建设PCR实验室:需要了解的问题有哪些?

什么是PCR?

聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。


PCR实验室有哪些要求?

PCR实验室又称临床基因扩增检验实验室、分子实验室,是分子诊断的基础,也是进行PCR实验的必备场所。原则上临床基因扩增检验实验室应当设置以下区域:试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。

这4个区域在物理空间上必须是完全相互独立的,各区域无论是在空间上还是在使用中,应当始终处于完全的分隔状态,不能有空气的直接相通,即各区要有独立的通风系统,并有缓冲间。为避免交叉污染,进入各个工作区域必须严格遵循单一方向进行,即只能从试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区。各实验区之间的试剂及样品传递应通过传递窗进行。


1、试剂储存和准备区

该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。试剂和用于标本制作的材料应直接运送至该区,不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内,并在本区内制备成所需的贮存试剂。对气流压力的控制,本区并没有严格的要求。

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2、标本制备区

该区域主要进行的操作为临床标本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。本区的压力梯度要求为:相对于邻近区域为正压,以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。另外,由于在操作中可能会发生气溶胶所致的污染,所以应避免在本区内不必要的走动。

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3、扩增区

该区域主要进行的操作为DNA或cDNA扩增。此外,已制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。本区的压力梯度要求为:相对于邻近区域为负压,以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染,应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作如加样等应在超净台内进行。

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4、扩增产物分析区

该区域主要进行的操作为扩增片段的测定分析。如使用全自动封闭分析仪器检测,此区域可不设。

当然,随着科技的发展,用于PCR检测的设备的功能及自动化均在不断的更新升级,根据使用仪器的功能,PCR实验室的功能区可适当合并。例如:使用实时荧光PCR仪,扩增区、扩增产物分析区可合并;使用集样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪,则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并。另外,没有什么是一成不变的,要因地制宜,具体问题要具体分析。


建设PCR实验室需要哪些设备?

PCR实验室并没有严格的净化要求,但是为避免各个实验区域间交叉污染的可能性,宜采用全送全排的气流组织形式。同时,要严格控制送、排风的比例以保证各实验区的压力要求。

1.试剂储存和准备区:

应包括2~8℃和-20℃以下冰箱、混匀器、微量加样器(覆盖0.2~1000μl)、固定紫外灯和可移动紫外灯(近工作台面)、消耗品、专用工作服、工作鞋(套)和专用办公用品。


2.标本制备区:

应包括2~8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱、低温高速离心机、混匀器、水浴箱或加热模块、微量加样器、可移动紫外灯(近工作台面)、二级生物安全柜、紫外分光光度计、消耗品、专用工作服和工作鞋(套)和专用办公用品。


3.扩增区:

应包括各种核酸扩增仪、微量加样器、可移动紫外灯(近工作台面);消耗品、专用工作服和工作鞋和专用办公用品。


4. 产物分析区:

应包括与检测项目相一致的设备、微量加样器、电泳仪器设备、凝胶成像系统、可移动紫外灯(近工作台面)、消耗品、专用工作服、工作鞋和专用办公用品。



PCR实验室污染的预防与控制

PCR实验室设计的核心问题是如何避免污染。在实际工作中,常见的有以下几种污染类型:扩增产物的污染;天然基因组DNA的污染;试剂的污染以及标本间的污染。由于一旦发生污染,实验就必须停止,直到找到污染源为止,而且实验结果必须作废,需重新进行实验。所以发生污染后再围绕实验室来寻找污染源不但耗时而且繁琐,浪费人力物力。因此要避免污染,首先应是预防,而不是排除。


  1、工作区域的严格划分

  2、合理的系统设置

  3、规范的操作

  4、严格的管理

  5、完备的实验室配套设施



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