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PCR 实验室

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PCR实验室又称基因扩增实验室,其特点是能将微量的DNA大幅增加,是分子生物学研究和实验的常规方法,广泛应用于生物学各个领域。例如:艾滋病检测、乙型肝炎、禽疫病、癌基因的检测和诊断,DNA指纹、个体识别、亲子鉴定及法医物证、动植物检疫,动物饲料、化妆品、食品卫生检测,转基因作物与转基因微生物检测等。

标准的PCR实验室分为四个区域:试剂准备区、样品制备区、扩增区和扩增产物分析区。为避免交叉污染,进入各个工作区域必须严格遵循单一方向进行,即只能从试剂贮存和准备区→样品制备区→扩增区→扩增产物分析区,各实验区之间的试剂及样品传递通过传递窗进行。

PCR实验室可以是分散形式,也可以是组合形式。

01


分散形式PCR实验室:

所谓分散形式PCR实验室,是指完成上述实验过程的实验用房彼此相距较远,呈分散布置形式。对于这种布置形式的PCR验室,由于各个实验之间不易相互干扰,因此无需特殊条件要求。

02


组合形式PCR实验室:

所谓组合形式PCR实验室,是指完成四个实验过程的实验用房相邻布置,组成独立实验区域的形式。对于组合形式PCR实验室,由于各个实验间集中布置,容易造成相互干扰,因此对总体布局以及屏障系统具有一定的要求。各室在入口处设缓冲间,以减少室内外空气交换。

PCR实验室主要功能



01


试剂贮存和准备区的功能:

贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备,以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。贮存试剂和用于标本制备的消耗品等材料应当直接运送至试剂贮存和准备区,不能经过扩增检测区,试剂盒中的阳性对照品及质控品不应当保存在该区,应当保存在标本处理区。

02


标本制备区的功能

核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管。对于涉及临床样本的操作,应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。由于在样本混合、核酸纯化过程中可能会发生气溶胶所致的污染,可通过在本区内设立正压条件,避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。为避免样本间的交叉污染,加入待测核酸后,必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料,必须在生物安全柜内开盖,并有明确的样本处理和灭活程序。

03


扩增区的功能

DNA合成、DNA扩增及检测。为避免气溶胶所致的污染,应当尽量减少在本区内的走动。必须注意的是,所有经过检测的反应管不得在此区域打开。

04


扩增产物分析区的功能

扩增片段的进一步分析测定,如杂交、酶切电泳、变性高效液相分析、测序等。核酸扩增后产物的分析方法多种多样,如膜上或微孔板或芯片上探针杂交方法(放射性核素标记或非放射性核素标记)、直接或酶切后琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、Southern转移、核酸测序方法、质谱分析等。


扩增产物分析区是PCR实验室最主要的扩增产物污染来源,因此应注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。在使用PCR-ELISA方法检测扩增产物时,必须使用洗板机洗板,废液必须收集至1 mol/L HCl中,并且不能在实验室内倾倒,而应当至远离PCR实验室的地方弃掉。用过的吸头也必须放至1 mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序处理,如焚烧。由于本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等,故应当注意实验人员的安全防护。


PCR实验室设计主要依据及标准

《医疗器械生产质量管理规范附录体外诊断试剂》、《医疗器械生产质量管理规范体外诊断试剂现场检查指导原则》条款中,明确对PCR试剂的生产和检验环境做出规定。此外现行卫生行业的法规、标准以及相关文献中对于PCR检验实验室均作出规定,主要涉及《全国临床检验规程》(第三版)、《医疗机构临床基因扩增管理办法》、《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》及《临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用》等行业标准的相关要求。


PCR实验室建设要点



01


主体结构

主体为洁净彩钢板和铝合金型材。房间内外角均采用铝合金50内圆角铝,解决了易污染、积灰、清洗困难的问题。结构牢固,线条简洁美观大方,密封性能好。

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标准的三区分隔和压差控制

将PCR过程分为试剂制备、样品制备和PCR扩增检测三个独立的实验区。整个区域有一个整体缓冲走廊。每个独立的实验区都有一个缓冲区。

PCR实验室空调通风系统设计及压力控制PCR实验室并设有严格的净化要求,但是为避免各个实验区域间交叉污染的可能性,宜采用全送全排的气流组织形式。同时,要严格控制送、排风的比例以保证各实验区的压力要求。

03


消毒

紫外线灯安装在三个实验区、三个缓冲区的顶部和转移窗内进行消毒。在试剂制备区和标本制备区还设置移动式紫外线灯,对实验台进行局部消毒。

04


不锈钢传递窗

试剂和标本通过传输窗口传输,确保试剂和标本在传输过程中不受污染。

05


地面

地面一般采用PVC卷材地面或自流地板,整体性好。易清洁,耐腐蚀。也可以使用水磨石地面,或大瓷砖(至少800mm×800mm)接缝需要小于2mm。尽量避免产尘和积尘现象。

06


照明

灯具应选用净化灯具,便于清洁、无尘。


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